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Collagenase, TypeI 膠原酶I型使用說(shuō)明書(shū)

發(fā)布時(shí)間:2017/11/15      點(diǎn)擊次數(shù):1988

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Collagenase, TypeI 膠原酶I型

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Collagenase, TypeI 膠原酶I型

C5100L0040

100mg

4℃避光

350

 

消化法中常使用的酶有3種:胰蛋白酶、膠原酶以及透明質(zhì)酸酶,透明質(zhì)酸酶多數(shù)情況下與胰蛋白酶或膠原酶聯(lián)合應(yīng)用;胰蛋白酶作用較強(qiáng),容易造成平滑肌細(xì)胞損壞;膠原酶作用較緩和,能消化細(xì)胞間質(zhì)中的膠原纖維以釋放細(xì)胞,對(duì)細(xì)胞損傷小,是*一種可以降解具有三股超螺旋結(jié)構(gòu)的天然膠原纖維的蛋白酶。

膠原酶(Collagenase)從溶組織梭菌(Clostridium histolyticum)提取的一種酶粗提物,也叫梭菌蛋白酶A(clostridiopeptidase A),不僅含有膠原酶,還含有其他的一些蛋白酶、多糖酶、脂酶等。這些成分分別能夠有效水解結(jié)締組織和上皮組織細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的其他蛋白,多糖和脂質(zhì)。該酶分離效果好,即使有鈣、鎂離子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制,既操作簡(jiǎn)便又可提高細(xì)胞成活率,zui終濃度200u/mL,此酶消化作用緩和,無(wú)需機(jī)械振蕩。

目前商業(yè)化提供的細(xì)菌膠原酶主要根據(jù)膠原酶活性的差異,分為四種類型:膠原酶I型,II型,III型和IV型,在應(yīng)用上有所偏向:1)膠原酶I(Type I Collagenase):含有比較均勻的各種酶活力(包括膠原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶活性)。通常用作上皮細(xì)胞、肝、肺、脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的制備;2)膠原酶II(Type II Collagenase):含有更高的梭菌蛋白酶活性,通常用于心臟、骨、肌肉、胸腺和軟骨等組織來(lái)源細(xì)胞的制備;3)膠原酶III(Type III Collagenase):含有較低的蛋白酶活性,常用于乳腺細(xì)胞的制備;4)膠原酶IV(Type IV Collagenase):含有低胰酶活性,通常用于胰島細(xì)胞的制備,或者需要維持受體完整性的細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)。

使用方法

1. 膠原酶儲(chǔ)存液的配制

向每管100mg的膠原酶中加入100µL的含Ca2+、Mg2+的HBSS(Hank’s平衡鹽溶液,含Ca2+、Mg2+),輕輕旋渦震蕩使其充分溶解,制備成1g/ml(即1000×)的儲(chǔ)存液。然后用低蛋白結(jié)合性的0.22μm的濾膜過(guò)濾除菌,分裝成小份量,然后于-20℃避光凍存。

使用前于冰上解凍,避免反復(fù)凍融。其用于組織和細(xì)胞分散的常用濃度為:0.5-2.5mg/ml,用于軟骨消化的常用濃度為1-2mg/ml,需要根據(jù)特定的實(shí)驗(yàn)條件或者參考相應(yīng)的文獻(xiàn)資料確定所需的*工作濃度。

2.組織的分離

1)使用無(wú)菌手術(shù)刀或剪刀將組織切成3-4mm大小的組織塊;

2)利用含Ca2+、Mg2+的HBSS洗滌組織塊數(shù)次;

3)加入足量的含Ca2+、Mg2+的HBSS,使其浸沒(méi)組織塊,并加入膠原酶至需要工作濃度;

4)于37℃孵育4-18h。消化時(shí)使用水平搖床以及用3mM的CaCl2補(bǔ)充消化可以提高消化效率。

5) 已分散開(kāi)的細(xì)胞可使用不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩篩得,收集備用。未*解離的組織另外添加適量的新鮮膠原酶工作液于37℃繼續(xù)孵育;

6)利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細(xì)胞數(shù)次;

7)細(xì)胞培養(yǎng)液重懸上述細(xì)胞,利用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器或其他方法計(jì)算活細(xì)胞密度。

8)于細(xì)胞培養(yǎng)皿上利用合適細(xì)胞培養(yǎng)基接種細(xì)胞。

3. 器官灌注

1)向37℃預(yù)熱的含Ca2+、Mg2+的HBSS中加入膠原酶,另添加3mM的CaCl2有助于提高分離效率;

2)按照已優(yōu)化的速率對(duì)相應(yīng)的器官灌注膠原酶工作液;

3)將上述過(guò)程中回收的灌注液流經(jīng)不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩,從而將已解離的細(xì)胞或小片段組織塊與較大團(tuán)塊分離開(kāi)來(lái),未充分解離的組織需利用新鮮膠原酶工作液于37℃進(jìn)一步孵育;

4)利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細(xì)胞數(shù)次;

5)細(xì)胞培養(yǎng)液重懸上述細(xì)胞,利用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器或其他方法計(jì)算活細(xì)胞密度。

6)于細(xì)胞培養(yǎng)皿上利用合適細(xì)胞培養(yǎng)基接種細(xì)胞

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