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Quick Cell 發光法支原體檢測試劑盒

產品描述

《Quick Cell發光法支原體檢測試劑盒》通過檢測支原體的特異性酶活性以達到檢測體外培養的哺乳動物細胞是否被支原體污染的目的。在支原體裂解后，該支原體特異性的酶，在底物存在下，具有將ADP轉化成ATP的功能。由于熒光素酶（Luciferase）催化底物熒光素（Luciferin）產生光的反應需要ATP的參與，支原體特異性酶催化產生的ATP含量，可以通過該反應轉化成生物發光（Bioluminescence）信號，該信號可以使用專門的發光檢測儀（Luminometer）或具有發光檢測功能的多功能酶標儀進行檢測，發光的強度與ATP的含量成正比。通過比較細胞培養上清和未用于細胞培養的培養液上清二者的支原體特異性酶的含量，即可知道培養的細胞是否被支原體污染。反應原理如下：

使用方法

1、檢測試劑的準備

產品從-80 ℃冰箱取出，在冰上操作，*次使用，分別用2.5 mL支原體檢測溶液溶解試劑A和試劑B, 按每管50 μL可分別分裝到50個1.5 mL離心管中，根據待檢測的樣品數量及陰性對照數量確定A,B試劑的用量（不用的試劑放置于-80 ℃冰箱低溫保存，隨用隨取）。試劑A和試劑B，放室溫5分鐘左右（注意：不能加熱），等其熔解后放冰上待用。

? 注意：試劑A和試劑B只能在每次檢測之前從-80 ℃冰箱取出的，熔解后在室溫放置的時間盡可能的短，不能超過20分鐘。熔解后，放冰上的時間也不能超2小時。已經融化后的試劑A和試劑B不能再次凍存使用。

2、陰性對照的設置

本試劑盒每次檢測都必須設置陰性對照。陰性對照除了沒有培養細胞外其他成分*相同，包括其中的血清批次、含量，抗生素等含量也必須*相同。陰性對照配制完后放于4℃冰箱。

3、待測樣品的準備

為了準確判斷細胞是否有支原體的污染，。具體操作如下（請嚴格按照相應的體積進行操作）：

（1）貼壁細胞待測的細胞培養3天且匯合度在70-90%左右時，取180 μL培養液上清上，在普通臺式離心機上200 g (大約1500 rpm )低速離心5 分鐘，準確吸取離心后的上清120 μL到一個新的1.5 mL離心管內，丟棄含細胞沉淀的原有離心管。

懸浮培養的細胞需要在換液傳代后，至少讓細胞生長3天再取培養液進行檢測。

注意：離心力要嚴格控制在200 g左右，該離心力下，哺乳動物細胞將被沉淀下來而支原體不會。更高的離心力將可能導致支原體也被離心下來，從而導致假陰性。而更低的離心力將可能導致哺乳動物細胞不能被離心沉淀下來，從而導致支原體經測時，哺乳動物細胞內的ATP也被釋放到溶液中，從而導致假陽性。

（2）將含有120 μL上清的1.5 mL離心管，在臺式離心機上16000 g (大約13000 rpm)高速離心3 分鐘，棄去上清（約108 μL）注意：切勿讓吸頭碰到離心管底部，底部為可能含有支原體的沉淀。往離心管內，加入108 μ*期配好的陰性對照培養液，并上下吹吸10次，將可能含有支原體的沉淀吹打均勻。該樣品用于后續的支原體檢測。

注意：將培養液替換成陰性對照的培養液是為了排除一些細胞代謝產物對后續檢測的可能干擾。

5、將熔解后的試劑A、試劑B、陰性對照和待測樣品放在室溫10分鐘左右（注意：不能加熱），以便其溫度與室溫相同，本試劑盒的*反應溫度為18-30℃，必須確保室溫不低于15℃。

注意：制備好的待測樣品如果不是當天立即檢測，放于-80℃冰箱保存，不得放于室溫、4 ℃或-20 ℃冰箱，樣品在-80℃可以保存一年左右；為了日后檢測方便，應該同時凍存一些作為陰性對照的培養液。

6、吸取50 μL陰性對照和待測樣品，分別放入不透明（白色或者黑色均可）的96孔板內，加入50 μL試劑A，室溫反應15分鐘。

7、加入50 μL試劑B，室溫反應3分鐘后，在多功能酶標儀或者發光檢測儀（Luminometer）上，以儀器默認的參數進行發光值的檢測，5分鐘內，連續測5次陰性對照和待測樣品的發光值，計算各自的平均值。

8、結果判斷

計算待測樣品的發光平均值與陰性對照的發光平均值的比值：

 ①如果比值>1.2，說明待測樣品有支原體污染（陽性）。嚴重的污染該比值可以達到10以上。

 ②如果比值在1.1-1.2之間，說明待測樣品可疑有支原體污染（可疑陽性）。該樣品需要繼續培養24-48小時后，重新檢測。如果繼續培養24-48小時后，重新檢測的比值仍然在1.1-1.2之間，應該判為陰性。

 ③如果比值<1.1，說明待測樣品無支原體污染（陰性）。

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