一、支原體污染檢測

1.     支原體檢測方法概述

支原體污染嚴重干擾細胞實驗結果，檢測有無支原體污染的方法較多，可以根據自身實驗室條件、檢測方法便捷性等作出選擇。

= 1 \* GB3 ①電子顯微鏡，相差顯微境觀察。用掃描電鏡或透射電鏡，直觀觀察支原體形態。或者在細胞培養瓶內預置蓋玻片，接種細胞在蓋玻片上，培養24小時后取出用油鏡觀察。如有支原體，因支原體與細胞在不同平面，可發現支原體呈現暗色顆粒裝。缺點：設備要求嚴格，檢測成本高，不適合普通實驗室日常常規檢測。

= 3 \* GB3 ③DNA熒光染色法，利用支原體沒有細胞膜（壁）的特性，用熒光染料Hoechst 33258染色， Hoechst 33258能與支原體DNA結合著色，在熒光顯微鏡下觀察，呈現綠色小點。缺點：靈敏度太低，當檢測成陽性時，細胞經常已經嚴重污染。

= 4 \* GB3 ④培養法，用支原體培養基大量增殖支原體，是相對可靠的支原體檢測技術。缺點：耗時長，需要數周時間才能得到結果，不適合作為細胞培養液中支原體污染的快速檢測。此外，該方法不能檢測豬鼻支原體，因為豬鼻支原體不能在固體培養基上形成可見的菌落，豬鼻支原體（M.Hyorhinis）約占所有支原體污染的20-50%。

= 5 \* GB3 ⑤PCR法，提取細胞培養液，提取支原體，制備樣品，根據支原體高度保守的16SrRNA序列設計引物（避免真核細胞或細菌DNA干擾），設置陰性，陽性對照，擴增產物經電泳后成像觀察，可識別已發現的幾乎全部100余種支原體。

= 6 \* GB3 ⑥Quick Cell快速檢測法，拓撲酶環化支原體DNA，在根據高保守區設計的引物引導下，采用特殊等溫DNA擴增酶，61℃條件下，連續滾環式擴增支原體DNA 60分鐘，根據有無支原體污染，隨著擴增進程可目視實驗結果。

= 7 \* GB3 ⑦化學發光法，裂解支原體后，有底物情況下，支原體特異性的酶，能將ADP轉化成ATP。ATP參與熒光素酶（Luciferase）催化底物熒光素（Luciferin）產生光的過程，所以可以通過催化底物熒光素導致的生物發光（Bioluminescence）信號來判別支原體DNA存在與否。

綜上所述，在多種支原體檢測方法中，受實驗條件、實驗時長、便捷性等因素限制， = 1 \* GB3 ①- = 4 \* GB3 ④僅在很少情況下得到應用。實際科研工作中，應用的是 = 5 \* GB3 ⑤ PCR支原體檢測法； = 6 \* GB3 ⑥Quick Cell快速支原體檢測法； = 7 \* GB3 ⑦化學發光支原體檢測法。

2.     幾種zui常用支原體檢測方法比較

3.     支原體檢測策略及方法選擇

①單個方法獨立檢測支原體（正確檢出率80%-99.9%）

就單個檢測方法及原理而言，“化學發光法”擁有zui高的正確檢出率（99.9%），用時zui短，應為方法?？蛇x產品為Lonza公司的MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit (CAT:C4056L1065，價格：約9800元/100次），或李記生物公司的“Quick Cell 支原體發光法檢測試劑盒（CAT:C4056L1065，價格：1250元/50次）”。

若受實驗室條件所限沒有配備化學發光檢測儀，或多功能酶標儀，建議選擇“Quick Cell快速檢測法”，該方法1小時出結果，避免了PCR法因細胞代謝產物抑制PCR反應導致的假陰性出現，正確檢出率大于99%，對設備幾乎無要求，可目測結果。產品可選李記生物公司的“Quick Cell支原體快速檢測試劑盒（CAT:C4056L1060，價格：1250元/50次）”。

 ②多原理支原體檢測策略

市場在售的所有支原體檢測試劑盒，目前沒有一種可以檢出全部可能的支原體污染，如果從事細胞治療、進行干細胞培養、生產血清、胰酶、培養液工作的科研人員，強烈建議選擇兩種以上檢測方法，確保支原體正確檢出率達到100%，避免關鍵實驗不必要的損失。

細胞培養支原體污染是個普遍性問題，污染來源很多，根據國外生物實驗室的規范做法，實驗室的支原體檢測要定期進行，一般一個月做一次支原體檢測，可以*時間確定支原體污染情況，顯著降低或避免支原體污染對細胞培養相關實驗的影響。

二、支原體污染去除

1.     支原體污染預防

根據可能的支原體污染來源，在體外細胞培養過程中，要嚴格控制環境污染；嚴格實驗操作；細胞培養基和實驗器材、耗材要保證無菌；在不影響實驗結果的前提下，可在細胞培養基中加入適量的特定抗生素；發現支原體污染后，要清除支原體，防微杜漸。

2.     支原體污染的去除及預防

因為支原體沒有細胞壁，一般用于細胞壁合成的抗生素對支原體沒有作用，如青霉素、萬古霉素多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺藥物普遍沒什么效果。對支原體zui有抑制活性及常用于支原體去除的抗生素是四環素類、大環內酯類及一些氟喹諾酮。在低濃度時，這些抗生素不會產生耐藥性，且對哺乳動物細胞的毒性較小。四環素和大環內酯能結合30S和50S核糖體亞基，從而抑制支原體蛋白質合成，喹諾酮抑制DNA旋轉酶。因此可以在細菌DNA復制及蛋白質合成兩個層面上抑制細菌生長，明顯增強除菌效果。

3.      支原體去除試劑選擇

選擇支原體去除試劑需要注意幾個關鍵幾點： ①細胞毒性小，毒性大的試劑在去除支原體的同時，會殺死細胞；②支原體去除效果，選擇廣譜試劑，去除多種支原體，以及細菌，真菌等； ③操作簡便，沒有二次污染；要考慮操作使用是否方便，因為如果使用起來比較麻煩，首先是費時費力，另外可能會帶來二次污染。目前市場上有多種支原體去除&預防試劑可選。包括李記生物的Quick Cell支原體預防/去除試劑，美國GenDEPOT公司的Cellmaxin，羅氏公司的BM-Cyclin，Biolnd的BIOMYC-1,BIOMYC-2,BIOMYC-3，以及Invivogen 公司的Plasmocin™ prophylactic和Plasmocin™ treatment 等。

 Quick Cell支原體預防及去除試劑和Cellmaxin都是從蛋白和DNA兩個層面去除支原體，抗菌譜廣。不同在于Quick Cell的使用者可以靈活選擇單獨或聯合使用兩種成分，分別或同時在蛋白或DNA層面去除支原體污染，細胞毒性更小。作用周期1-2周，支原體去除率大于92%。去除預防兼顧

BM-Cyclin包含泰妙菌素（BM-Cyclin 1）和二甲胺四環素（BM-Cyclin 2）兩種成分，抑制支原體及細菌生長，去除培養細胞中已感染的支原體。適用于多種培養細胞，無明顯副作用，又不影響細胞本身的代謝，而且處理過的細胞不會重新感染支原體。BM-Cyclin需聯合使用，作用周期2周，可消除80%以上的支原體。不確定能否預防。

BIOMYC-1基于抗生素泰妙菌素，由真菌pleurotus mutilus 產生。 BIOMYC-2基于二甲胺四環素，四環素衍生物。此兩種抗生素溶液通常按先后聯合使用2－3次循環約一周以上，可取得良好的效果。BIOMYC-3 基于抗生素環丙沙星，屬于氟喹酮類。許多支原體被證明對BIOMYC-3敏感，需要根據支原體種類使用。處理周期2周，能去除90%的支原體。是否可以預防支原體目前還不能確定。

Plasmocin™ prophylactic和Plasmocin™ treatment也是兩種抗生素的混合物，包含兩個針對支原體的有效成分，作用于蛋白質合成和DNA復制階段，對許多細菌和真核細胞則沒有影響。作用周期2周，去除效率未知。有兩個濃度包裝，去除用高濃度，預防用低濃度。